東大 理学系研究科 生物科学専攻 専門科目 2024年度 院試 過去問 解答例・解説（解説5項目）

設問1　取り込み前の選択と取り込み後の校正

DNA合成では、伸長鎖の3′OHが入ってくるdNTPのαリン酸へ反応し、ピロリン酸を放して新しいホスホジエステル結合を作る。合成方向は5′→3′である。まず酵素は、鋳型と正しいワトソン・クリック塩基対を作る基質を反応に適した配置へ置く。誤った塩基対では配置や酵素の構造変化が適切に進みにくく、反応へ入る速さが低くなる。

この選択は、溶液中で相補的塩基が偶然に水素結合することだけではない。酵素の活性部位の幾何学的な適合と、取り込みへ至る複数段階の速度差が誤りを排除する。正しい基質と誤った基質の結合・反応の速さを精製系で比較すれば、選択の程度を調べられる。塩基対の水素結合が強ければ全て同じように速く重合する、とは説明しない。

それでも誤った塩基が入ることはある。複製型の多くのDNAポリメラーゼでは、不対合した3′末端からの伸長が遅くなり、末端が校正部位へ移って切り取られる。その後、正しい対合を持つ末端を合成部位へ戻す。3′→5′の切除は5′→3′の合成と逆向きに末端を戻す作用であり、合成全体が3′→5′になる意味ではない。

単純な例として、取り込み時の誤り率を $\varepsilon$、取り込んだ誤りのうち校正を逃れる割合を $s$ とすれば、残る誤りは概ね $\varepsilon s$ となる。$\varepsilon=10^{-5},s=10^{-2}$ なら $10^{-7}$ である。二つの選別段階が重なる効果を示す例であり、全酵素に共通の実測値ではない。校正活性だけを失わせた変異体との比較で、この寄与を検査できる。

「5′→3′エキソヌクレアーゼで新生3′末端を校正する」と書くと、切る端と方向が合わない。また複製後のミスマッチ修復も正確性へ寄与するが、これはポリメラーゼ自身の取り込み・校正とは別の装置である。問われた二機構を、取り込む前と後に分けて答える。

設問2　変異の供給と環境への適応

突然変異は新しい配列の変化を供給し、自然選択はその変化が生存・増殖へ与える効果によって、集団内の割合を変える。逆転写酵素の正確性が低い場合、一回の複製で異なる配列が生じやすくなり、ウイルス集団の多様性を増す要因になる。薬や抗体が必要な変異を狙って作るという説明ではない。

例えばある薬が野生型の酵素へ強く作用しても、薬の結合を弱め、なお必要な触媒活性を保つ変異があれば、その変異体は薬の存在下で相対的に増えやすい。免疫に認識される部分の変化にも同様の可能性がある。一方、増殖に必須の機能を壊す変異は不利なので、多様性の増加と適応度の向上を常に同じものとはしない。

独立な $N$ 回の複製で、ある有用な変異が生じる確率を一回あたり $u$ とする単純なモデルでは、少なくとも一度生じる確率は $1-(1-u)^N$ である。$Nu$ が小さければ概ね $Nu$ だが、確率は1を超えない。この式は変異が供給される段階の説明であり、生じた変異が必ず集団へ定着する確率を示すものではない。

また変異が多すぎれば有害な変化が蓄積し、複製可能なゲノムを保ちにくくなる。正確性が低いほどどんな場合も優秀なウイルスになる、という一方向の結論は避ける。複製数、ゲノム長、変異の効果、集団の大きさなどの条件の中で、変異供給の利点と有害な誤りの費用がある。

「ウイルスが薬へ慣れたので各個体が必要な塩基を書き換える」とすると、集団に生じる変異と選択を個体の目的的な変化へ置き換えてしまう。実験なら投薬前後の配列頻度、各変異の薬感受性と増殖速度を比較し、変異の供給と、その後の選択を分けて確かめる。

設問3　RNAゲノムとプロウイルス

レトロウイルスの粒子はRNAをゲノムとして持つ。感染後に逆転写酵素でDNAを作り、そのDNAが宿主染色体へ組み込まれたものをプロウイルスと呼ぶ。宿主の転写装置がプロウイルスからRNAを合成し、RNAはタンパク質合成の鋳型や、新しい粒子に入るゲノムとして使われる。この流れはRNAからDNA、さらにDNAからRNAという二方向を含む。

アはこのRNAゲノムからDNAを作り、転写で新しいRNAを得る流れを述べるので適切である。ウも宿主染色体への組込みというレトロウイルスの生活環の段階を示す。DNAができたことと組込みは別の反応であり、組込みにはインテグラーゼなどの働きが関わる。逆転写酵素だけを入れれば、合成したDNAが必ず染色体へ入るわけではない。

イはゲノムがDNAで、RNAを経て再びDNAを作る別の型の記述であり、レトロウイルスのRNAゲノムという条件と異なる。逆転写を利用するウイルスが全て同じ分類に入るわけではない。反応の名前だけで判断せず、粒子に入るゲノムの種類と複製の途中に現れる分子を分ける。

SARS-CoV-2はRNAウイルスだが、通常の複製ではRNA依存性RNAポリメラーゼでRNAからRNAを作り、レトロウイルスではない。RNAゲノムを持つことはレトロウイルスであるための十分条件ではなく、逆転写とプロウイルスを含む複製様式が必要となる。従ってエは選ばない。

検算には、各選択肢について「粒子のゲノム」「複製途中のDNA」「染色体への組込み」「子孫粒子のRNA」を一列に並べる。「RNAウイルスは全て逆転写する」という誤りと、「DNAがある段階を持つのでゲノムはDNA」という誤りは、この段階の区別で見付けられる。

設問4　RNAから二本鎖cDNAを作る

cDNAは、RNAを鋳型として作った相補的DNAである。組織のmRNAから作る場合、その組織と時点で発現していた転写産物を反映する。成熟mRNAを使えば、ゲノムDNAにあるイントロンなどがそのまま全て含まれるわけではない。したがってcDNAを作る操作と、ゲノム全体を複製する操作を区別する。

逆転写酵素も伸長開始に3′OHを持つプライマーを必要とする。真核mRNAの多くが持つポリAへオリゴdTを結合させれば、そこからRNAと相補的な第一DNA鎖を5′→3′へ伸ばせる。特定のRNAを狙う配列特異的プライマーや、複数の位置から始めるランダムプライマーも選択肢となる。標的RNAがポリAを持たない条件で、オリゴdTなら何でも取れるとはしない。

第一鎖の後にはRNAをRNase Hなどで処理し、残ったDNAを鋳型として第二鎖を合成する。第二鎖用の開始点を用意し、DNAポリメラーゼを働かせる。RNA断片を第二鎖合成の足場として使う方法など複数の手順があるため、ここではRNAの除去と第二鎖のプライミングを備えた方法として答える。逆転写酵素の一反応だけで、常に完全な二本鎖が自動的に得られるとは書かない。

試料にはゲノムDNAが混じり得るので、RNAの精製と必要なDNase処理を行う。RTを入れない陰性対照でDNA増幅が残れば、後の解析がRNA由来かを疑う材料になる。またRNAの分解があると、長いcDNAができにくい。得た産物の長さや、既知の転写産物を使う陽性対照を確認すると工程を検査できる。

「RNAをそのままPCRで二本鎖DNAにする」とすると、通常のDNA依存性DNAポリメラーゼへRNA鋳型の逆転写まで任せてしまう。設問が指定する始めと終わりの表現を守り、RNA精製、第一鎖、RNA処理、第二鎖の順に答える。

設問5　細胞の種類と薬剤を組み合わせる発現設計

本設計は、細胞種の情報と薬剤の情報を二段階で合わせる。Yは神経系前駆細胞にだけ存在するので、Y応答性の調節領域を使うと、その細胞でZを発現させられる。Zは薬剤Aを結合した時だけZ応答領域へ作用するので、GFPをその下流へ置けば、細胞種が合い、薬剤もあるという条件を作れる。

論理式では、GFPの発現は概念的に $Y\ \mathrm{AND}\ A$ に対応する。Yなし・Aなし、Yなし・Aあり、Yあり・Aなしでは発現せず、Yあり・Aありで発現する。薬剤だけへGFPを直接つなぐと全ての細胞で応答し得るし、Y応答領域へGFPを直接置くと薬剤を与えなくても発現する。この二つの一条件だけの設計は、本文の特異性を満たさない。

調節領域は、その下流の遺伝子を転写できる最小プロモーターなどと組み合わせる。またZ遺伝子自体をYで制御するので、Zが哺乳類にもともとないという条件に対応できる。GFPの遺伝子だけを導入しても、Zという人工的なスイッチがなければ薬剤Aの情報を読めない。

実験では四条件を比較し、Yのない細胞でもGFPが出ないこと、Aなしの背景が十分低いこと、Aを除くと新規転写が止まることを確認する。GFPタンパク質は安定なので、転写を止めた直後に蛍光が消えるわけではない。新しいRNAの量と、すでに作った蛍光タンパク質を区別する必要がある。

この二段階設計は、薬剤投与の時刻に標識を入れて、その後の子孫へ残ったGFPを追跡する実験に適する。ただし個々の細胞で標識量が同じという条件は、投与や発現の効率も含めて検証する。回路が正しく設計されていることと、全細胞が定量的に同じ量を作ったことは別の主張である。

設問6　挿入位置による発現の変化

ゲノムDNAは裸の糸として存在するのではなく、ヒストンなどとクロマチンを作る。ある領域が転写装置へ近付きやすい状態か、抑制的な状態かは、その近傍の修飾や調節因子によって異なる。外来のプロモーターと遺伝子を同じ配列で導入しても、この周囲の環境の影響を受ける場合がある。

例えば強く抑制されたヘテロクロマチン近くへ挿入すると、導入したプロモーターも働きにくくなり得る。反対に活発なエンハンサーの近傍では、設計した条件に加えて別の転写作用を受ける場合がある。どちらもDNAの文字列を必ず突然変異させる必要はなく、使われ方が変わるという位置効果である。

単純にはRNAの定常量を $R_*=k_{\rm tx}/k_{\rm deg}$ と書ける。同じRNAの分解速度を仮定し、挿入位置のため転写速度 $k_{\rm tx}$ が十分の一になれば、定常RNA量も十分の一となる。一方、RNA量の差だけでは転写と分解を厳密には分けられないので、新規転写やクロマチンの状態を別に測ると原因を検査できる。

比較には、独立な挿入系統を複数作る、挿入部位とコピー数を同定する、同じ標的部位へ一コピーずつ入れる方法などがある。コピー数が違うことも発現へ影響するが、それは挿入位置そのものの効果と区別してそろえる必要がある。導入配列の破損や再配列も検査する。

「全細胞で同じDNAがあるので、全細胞で同じ量が発現する」とするのは、DNAの存在と転写の制御を混同している。また挿入先の近くにある内在遺伝子が必ず外来遺伝子のタンパク質を作るという説明でもない。外来遺伝子自身のプロモーターが受ける周囲の作用として、位置効果を答える。

設問7　蛍光の希釈から神経細胞の誕生順を読む

標識後のGFPは新しく合成されず、分解も無視でき、分裂時には娘へ等しく配られると指定されている。従って一個の前駆細胞が持つGFP量を $G_0$ とすると、一回の分裂後の各娘は $G_0/2$ になる。前駆細胞として残った娘がさらに分裂すれば、その次の娘は $G_0/4$ となる。

$n$ 回目の分裂でできた神経細胞の量は $G_n=G_0/2^n$ である。神経細胞はその後に分裂しないため、その時点の量を保つ。例えば最初の神経細胞が $G_0/2$、三回目のものが $G_0/8$ なら、早いものの量は四倍になる。各神経細胞の容積が同じという条件もあるので、蛍光濃度の大小を細胞サイズの差で説明する必要はない。

図ではGFPの多い神経細胞が脳室側、少ないものが脳表面側にある。多い量は早い誕生、少ない量は後の誕生を表すので、二つの対応を合わせると、早い細胞が内側へ、遅い細胞が外側へ置かれる。神経細胞は速やかに最終位置へ移動するという条件により、一時的な移動途中の位置を見ているという解釈も除いている。

量の保存を別に検算すると、三回分裂した後には、順にできた神経細胞に $G_0/2,G_0/4,G_0/8$、残る前駆細胞に $G_0/8$ があり、合計は $G_0$ になる。希釈はタンパク質を消した結果ではなく、細胞の数を増やして分配した結果である。もし新規合成や分解が大きければ、この単純な誕生時計としては使えない。

「蛍光が弱いほど古く、時間とともに分解した」とすると、GFPが安定という指定に反する。また神経細胞自身の分裂回数が多いと説明するのも、神経細胞が分裂しない条件に反する。前駆細胞の分裂履歴と、そこから離れた神経細胞が保存する量を分けて追う。

設問8　X染色体不活化による細胞のモザイク

哺乳類の雌では、発生の過程で二本のXのうち一方の多くの遺伝子の転写が抑えられ、遺伝子量を調節する。胚本体での無作為なX染色体不活化では、母由来か父由来かの選択が細胞によって異なり、選んだ状態は基本的に分裂後の細胞へ引き継がれる。DNAのFと変異型が染色体から消えるのではなく、主に発現する側が異なる。

正常Fを持つXが活性なら、必要なFタンパク質を作るため移動できる。逆に変異型を持つXが活性なら、正常なFが足りず移動できない。この細胞ごとの状態の違いで、同じ個体の同じヘテロ接合遺伝子型から、二種類の機能を持つ細胞が生じる。全細胞が両アレルを同量ずつ発現しているというモデルとは異なる。

不活化が起こる前駆段階の独立した細胞を $n$ 個と理想化し、正常側が活性になる確率を1/2とすれば、その個数 $K$ は二項分布を持ち、$E[K/n]=1/2$、分散は $1/(4n)$ となる。ただし実際の神経細胞は一つの祖先細胞からクローン状に増えるので、全神経細胞を独立な抽選とみなすことはできない。このため一個体ごとに厳密な50\%を要求せず、多数個体の平均が半分という原題に対応させる。

さらに本問は、Fが移動だけに影響し、移動異常が他の細胞を変えないと指定する。従って変異型の集団ができても、正常Fの細胞の移動を巻き込んで止めたり、逆に正常細胞が全てを救ったりする仮定を置かない。正常に移動した細胞と脳室近くへ残る細胞の混在が、細胞に自律的な機能差を反映する。

「減数分裂で半分の体細胞がFだけ、半分が変異型だけを持つ」とすると、体細胞での染色体の継承を誤っている。両者のDNAは保持したまま、活性のXが異なる。また一つの細胞が毎回無作為にXを切り替えると説明すると、クローンに維持される不活化状態と合わない。遺伝子型、発現状態、細胞の移動を順に分けて説明する。