東大 理学系研究科 生物科学専攻 専門科目 2019年度 院試 過去問 解答例・解説（解説10項目）

設問1　ゲノムの大きさと染色体の部位

ヒトの一組の核ゲノムは約$3\times10^9$塩基対、すなわち30億塩基対である。通常の二倍体細胞では父母の二組を持つので、複製前の核DNA量は約60億塩基対となる。本文の「ヒトのゲノム」は一組を数える慣用に従い、二倍体細胞一個のDNA総量と混同しない。

mRNAのコドンをアミノ酸の並びへ変換する過程が翻訳であり、DNAからRNAを作る転写と区別する。S期には二本の親鎖をそれぞれ鋳型とする半保存的な複製で姉妹染色分体が作られる。複製は遺伝情報のコピーであって、細胞全体の分裂そのものではない。

セントロメアには動原体が形成され、分配装置と染色体を結ぶ。姉妹間のコヒーシンによる結合もこの近傍で強く保たれる。一方、テロメアは線状染色体の端を保護し、通常のDNA切断端と区別する構造である。両者は染色体上の位置も役割も違う。

「アは60」「エはテロメア」とすると、それぞれ一組と二組、中央付近の分配部位と末端を取り違える。また全てのヒト細胞が同じ分裂回数で死ぬとまではいえない。テロメラーゼの有無などで末端の維持条件は変わるため、本文の可能性という範囲を保って答える。

設問2　非コードRNAの例1：リボソームRNA

非コードRNAは、機能する産物がRNAそのものであり、通常はタンパク質へ翻訳されないRNAをいう。「コードしていない」は何の働きもないという意味ではない。構造を作る、反応を触媒する、別の核酸を認識するなど、RNAの構造と塩基対形成を使う働きがある。

rRNAはリボソームを構成し、リボソームタンパク質と組み合わさる。大サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ中心では、rRNAが反応中心を形作る。アミノ酸同士を正しい位置へ置き、ペプチド結合の形成へ結び付けるため、単なる受動的な足場とだけ説明しない。

小サブユニットのrRNAはmRNAとtRNAの認識にも関わる。新生ペプチドを作る情報はmRNAから読み、rRNAは装置の一部としてそれを実行する。この区分で、同じ「翻訳に必要なRNA」でも情報を持つ鋳型と触媒・構造を担う分子が違うことを確かめる。

「rRNAはリボソームのタンパク質へ翻訳されるRNA」とすると、名称から機能を逆に推測している。またRNAをタンパク質と共存するだけの不純物とすれば、RNAが反応中心へ入る性質を説明できない。答案ではncRNAという総称とrRNAの具体的な役割を両方書く。

設問2　非コードRNAの例2：転移RNA

tRNAは、核酸の言語とタンパク質の言語をつなぐアダプターである。片側にコドンを読むアンチコドンを持ち、もう一方の3′末端CCAへアミノ酸がエステル結合する。mRNAへ相補的に結び付く部分と、運ぶアミノ酸の付く部分が同じ分子へ分担されている。

アミノ酸を結び付ける反応はアミノアシルtRNA合成酵素が行い、ATPを用いてアミノ酸を活性化する。酵素がアミノ酸とtRNAを選ぶため、アンチコドンの認識だけで正しいアミノ酸が保証されるわけではない。リボソームは主にコドンとアンチコドンの対応を読み、そのtRNAへ載ったアミノ酸を使う。

例えば誤ったアミノ酸を人工的に同じtRNAへ載せると、コドンが同じでも別のアミノ酸を取り込ませ得る。この反例は、読み取りとアミノ酸の装填が別段階であることを確かめる。実際の細胞では合成酵素の選択性や校正が誤りを減らしている。

「tRNAはmRNAを別のRNAへ転写する酵素」と答えると、鋳型のコピーと翻訳の運搬を混同する。またtRNA自身が運搬後に毎回翻訳されて消費されるわけでもない。アミノ酸を渡した後のtRNAは再び装填を受け、繰り返し使われる。

設問2　非コードRNAの例3：マイクロRNA

miRNAは短いRNAを案内として標的を選ぶ仕組みに使われる。前駆体が加工され、一方の鎖がArgonauteなどを含むRISCへ取り込まれる。miRNAの塩基と標的mRNAの塩基が対応するため、タンパク質の形だけでなく核酸配列によって標的を区別できる。

動物の多くの標的では、5′側のシード領域などの相補性が認識へ関わり、翻訳抑制、ポリA鎖の短縮、mRNA分解などへつながる。一方、十分な相補性と切断能を持つArgonauteがそろう場合には標的切断も起こる。全てのmiRNAがどんな標的も同じ位置で切るという法則ではない。

標的mRNA量が変わらずタンパク質だけが減る場合もあり得るので、機能の検証にはRNA量と翻訳産物の両方を比べる。標的部位を変えると抑制が失われるレポーター実験は、配列に依存する認識という説明を確かめる方法となる。

「miRNAは必ず標的DNAを切断する」とすると、作用する核酸と反応を取り違える。また一つのmiRNAが一つのタンパク質へ翻訳され、その酵素が抑制するわけではない。案内RNAとしての相補性と、複合体の作用を分けて説明する。

設問3(1)　DNAメチル化の配列

DNAのシトシンの5位へメチル基が付く修飾が5-メチルシトシンである。ヒトを含む哺乳類では、通常CpGのCが主な標的となる。CpGのpは同じ鎖で隣り合うCとGを結ぶリン酸を表し、向かい合う鎖のC--G塩基対の略ではない。

5′-CG-3′の相補鎖も、逆向きに5′から読めばCGとなる。この対称性のため、複製後に親鎖だけがメチル化された半メチル化状態を手掛かりとして、新しい鎖へ修飾を補う維持機構を説明できる。配列と修飾状態を別に継承する仕組みである。

原題のCAAGには同じ鎖でCの直後にGがなく、CpGという対応へ合わない。従って下線の配列を直す。なお非CpGメチル化も特定の細胞や生物では存在するため、「真核生物のあらゆるCメチル化が例外なくCGのみ」と絶対化しない。

「CとGは塩基対を作るから全てのCがCpG」とすれば、二本鎖の相補性と一本の鎖上の隣接を混同する。またメチル化でCがGへ置換されるわけでもない。修飾する原子の位置、同じ鎖の隣接、複製後の対称性の三点で誤りを確かめる。

設問3(2)　ヒストンの正電荷を中和する

リシンの側鎖は中性付近で主に$-NH_3^+$となり、正電荷を持つ。アセチル化ではこのアミノ基へアセチル基が付き、アミドとなるため、その部位の正電荷が概ね一つ減る。セリンのOHに負電荷があるからそれを消す、という反応ではない。

DNAのリン酸骨格は負なので、ヒストンの正電荷はDNAとの引力へ寄与する。二電荷の近似$U=q_1q_2/(4\pi\varepsilon r)$では異符号なら負となるため、正電荷を減らすとこの有利な寄与が小さくなる。クロマチンへの因子の接近がしやすくなる一つの説明である。

実際にはアセチル化を認識するタンパク質の募集やヌクレオソームの配置も影響する。一か所のアセチル化だけで全てのヒストンがDNAから脱落すると決まるわけではない。部位と組合せ、細胞内の因子を条件として残す。

「正電荷を負電荷へ反転する」とすると、通常のリシンのアセチル化の変化量を誤る。もとが+1なら概ね0となり、−1へはならない。またセリンのリン酸化と混同すると修飾基と標的の両方を外す。原文の残基名と電荷の符号を一緒に直す。

設問3(3)　アセチル化の可逆性

可逆的な修飾とは、修飾された分子を必ず分解して作り直さなくても、化学基を付けたり外したりできることをいう。ヒストンのリシンのアセチル化では、アセチル基転移酵素が付加し、脱アセチル化酵素が除去する。両方向へ働く酵素系があることが、可逆という判定の根拠である。

付加にはアセチルCoAなどの供与体が必要であり、除去の反応には酵素の型に応じた化学機構がある。逆向きの状態変化が可能だからといって、付加と除去が同じ酵素の同じ反応を平衡のまま逆転しただけとは限らない。

細胞内では、付加と除去の速度の釣り合いが各部位の修飾率を変える。刺激で付加酵素が募集されれば率が上がり、除去が優勢なら下がる。従って一時点の修飾を観測しただけで、その部位が永久に固定されたと解釈しない。

「一度アセチル化されたリシンは、DNAの突然変異のように必ず次代まで固定される」とすれば、配列変化と可逆な修飾を混同する。また可逆だから転写への作用が必ずゼロになるともいえない。二つの反応速度を別々に変えた時の予測で確かめる。

設問3(4)　同じメチル基でも基質は異なる

酵素は付加する小さい化学基だけでなく、受け取る基質と反応部位を認識する。DNAメチル基転移酵素はDNAのCなどを基質とし、ヒストンのメチル基転移酵素はタンパク質のリシンやアルギニンなどを基質とする。DNAの環上炭素と、アミノ酸側鎖の窒素では化学環境が異なる。

多くの反応がS-アデノシルメチオニンをメチル供与体として使っても、同じ酵素になるわけではない。これは同じATPを使う反応が全て同じキナーゼで進むわけではないことと同様である。供与体の共通性と基質特異性を分ける。

ヒストンには部位によって一・二・三メチル化などの違いもあり、それぞれを認識する因子と遺伝子発現への作用も異なる。DNAとヒストンが共にメチル化されたという情報だけでは、両方が必ず同じ方向へ転写を変えるとも決まらない。

「メチル基は同じなので一種類の酵素がDNAも全ヒストンも修飾する」とすると、基質の立体配置と反応原子の認識を落としている。また全ヒストンのメチル化をアセチル化と同じ電荷中和へ置き換えるのも誤りである。共通する化学基と、異なる反応の相手を整理して判定する。

設問4　紫外線損傷を含む短い鎖を切り出す

紫外線は同じDNA鎖で隣り合うピリミジン塩基の間へ異常な共有結合を生じさせ得る。代表例がシクロブタン型の二量体で、らせんや読み取りを乱す。単なる二本鎖の正常な水素結合が二つになったという意味ではない。

ヌクレオチド除去修復では、損傷部位を含む短いオリゴヌクレオチドを一本の鎖から除去する。損傷していない反対鎖が残るため、除去した塩基の順番を相補性によって回復できる。真核細胞では認識や局所的な開裂、両側の切断に複数の因子が分担する。

DNAポリメラーゼは残った3′OHから5′→3′へ伸長して隙間を埋めるが、最後の隣接する3′OHと5′リン酸の間には切れ目が残る。この一本鎖骨格の切れ目がニックであり、DNAリガーゼがホスホジエステル結合を作って閉じる。合成と結合の段階を順に区別する。

「ヌクレアーゼが損傷のない鎖まで全て分解する」とすれば、正しい配列を復元する鋳型を失う。「リガーゼが不足する塩基を順番に合成する」としても酵素の役割が逆になる。指定の五語を、損傷、切断、補充、最後の結合の因果へ置いて確認する。

設問5(g)　相補的なプローブで発現の場所を読む

in situは、細胞や組織の位置関係を残したまま調べることを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸同士の相補的な塩基対形成である。従って抗体によるタンパク質検出と同じ操作ではなく、目的のRNAへ結び付く核酸プローブを設計する。

温度、塩濃度、プローブ長などは、標的と非標的をどこまで区別できるかへ影響する。条件が緩過ぎれば似た別のRNAへも結合し、厳し過ぎれば目的の結合も失う。固定と透過処理は、位置を保ちながらプローブを内部へ届かせるために必要である。

原題でAとBが同じ細胞Pに見えることは、両者が同じ細胞で働く機会を持つという証拠になる。ただしRNAの局在が重なるだけでは、タンパク質同士の直接結合や転写の上下関係まで決まらない。時間あたりの発現量の比較には、次の定量測定も組み合わせる。

「同じ色の染色なのでAがBを直接活性化する」とするのは、共存を因果へ飛躍させている。センスプローブ、標的欠損、標識なしなどの対照で非特異的な信号を確かめる。また蛍光の強さだけを、条件の違う二遺伝子間の正確なRNA分子数へそのまま換算しない。

設問5(h)　逆転写後の増幅を定量する

RNAはそのまま通常のDNAポリメラーゼの鋳型として定量PCRへかけられないため、逆転写でcDNAへ写す。増幅効率を$E$とすると、指数増幅域では$N_c=N_0(1+E)^c$である。同じ閾値へ達するまでに必要なサイクル数が少ないほど、初期量$N_0$が多かったと分かる。

完全な二倍増幅、すなわち$E=1$なら、同じ閾値に一サイクル早く達した試料は初期量が約二倍である。標的と対照のCt差を$\Delta Ct$とし、比較条件間の差を$\Delta\Delta Ct$とすれば、同効率などの条件で相対量は$2^{-\Delta\Delta Ct}$となる。

内在性対照自身が分化に伴って変わると、割り算の基準が動いてしまう。生物学的反復、安定した基準遺伝子、逆転写なしの対照、プライマーの特異性などを確認する。原題の図はA・Bそれぞれの時間変化を比べるもので、PCR産物の終点量だけでは指数域の情報を失い得る。

「Ctが二倍だからmRNAも二倍」とするのは対数的な関係を無視する。例えばCtが二サイクル遅ければ、等効率の模型では初期量は$1/4$であり二倍ではない。逆転写効率や混入ゲノムDNAの影響を確かめてから、RNA量の変化として読む。

設問6(1)　誘導と負のフィードバックの仮説

まず観測されたRNAの順序と、欠損の効果を分ける。野生型ではAが先に上がり、その後Bが上がる。Aの欠損でBが上がらないため、Aの存在がBの誘導に必要という関係が支持される。ただしAがBのプロモーターへ直接結合することまで、時間差だけで決まるわけではない。

Bの欠損でもAは最初に増えるので、Aを初めて誘導するためにBが必須という模型は合わない。一方、野生型のAは後で低下するのに、B欠損では高く保たれる。従ってB自身、またはBによる分化後の状態がAの発現を抑える負の帰還を考えられる。

例えば単純化して$dA/dt=s(t)/(1+B/K)-d_AA$、$dB/dt=vA/(K_A+A)-d_BB$と書けば、先にAを与える外部入力と、BによるA産生の抑制を同時に表せる。式は原題から速度定数を求めた実測モデルではなく、矢印の向きが観測と両立することを示す作業仮説である。

「AとBは同時に発現するから完全に同じ働き」とすれば、異なるKOのRNA波形を説明できない。またAが長く高いB欠損でも未分化なので、「Aさえ高ければ必ず分化」ともいえない。必要性と十分性、直接作用と間接作用を区別した結論にする。

設問6(2)　予測の違う介入で関係を検証する

作業仮説を確かめるには、相関した二量を再測定するだけでなく、一方を変えた時のもう一方の予測を試す。Aの誘導でBが上がり、Aを失うと上がらないなら、必要性と誘導可能性を別々に確かめられる。誘導薬だけ、空ベクター、正常量の相補などを比較し、処理の一般作用を除く。

AがBのDNAへ直接働く仮説なら、Bの制御領域への結合、候補結合配列の変異、変異に伴う誘導消失などを組み合わせる。ChIPの濃縮だけでは別タンパク質を介した同居もあり得るため、精製分子での結合や部位依存性も直接性の検査に役立つ。

BによるAの低下は、Aの転写が減る場合とmRNAの寿命が短くなる場合を区別する。新生転写の測定や転写停止後の減衰を調べれば、$dA/dt=s-dA$の産生$s$と分解定数$d$を分けられる。帰還を検証するときには、分化そのものが変わった間接効果も比較条件へ残す。

「B欠損へ大量のAを入れ、分化しなければAはBの上流でない」と直ちに結論すると、B自体が必要な模型を誤って除く。A欠損へBを発現して救済するかは有用だが、救済しなくてもAの別の作用が残る。各操作がどの仮説のどの部分を試すかを明示する。