酵素反応速度論ミカエリス・メンテン式・Km と Vmax の求め方・阻害様式

酵素反応の初速度 $v$ は、基質濃度 $[\mathrm{S}]$ が低いと比例して増え、高いと最大速度 $V_{\max}$ に近づく。この関係を表すのがミカエリス・メンテン式 $v = V_{\max}[\mathrm{S}]/(K_m + [\mathrm{S}])$ で、 $K_m$ は $v = V_{\max}/2$ になる基質濃度である。 $K_m$ と $V_{\max}$ は、 $1/v$ を $1/[\mathrm{S}]$ に対してプロットした直線の切片と傾きから求める。阻害剤の種類は、阻害剤を加えたときに $K_m$ と $V_{\max}$ のどちらが見かけ上変わるかで見分ける。

生化学の第2単元（全3単元）。

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反応の模型と速度の定義

定義

ミカエリス・メンテンの反応模型

酵素 $\mathrm{E}$ と基質 $\mathrm{S}$ が可逆的に複合体 $\mathrm{ES}$ を作り、そこから生成物 $\mathrm{P}$ ができる。

\mathrm{E} + \mathrm{S} \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} \mathrm{ES} \overset{k_2}{\longrightarrow} \mathrm{E} + \mathrm{P}

速度 $v$ は生成物の生成速度 $v = d[\mathrm{P}]/dt = k_2[\mathrm{ES}]$ で、反応を始めた直後の初速度を測る。酵素の総濃度は $[\mathrm{E}]_t = [\mathrm{E}] + [\mathrm{ES}]$ で一定とする。

定義

$K_m$ ・ $V_{\max}$ ・ $k_{\mathrm{cat}}$

$K_m = (k_{-1} + k_2)/k_1$ をミカエリス定数、 $V_{\max} = k_{\mathrm{cat}}[\mathrm{E}]_t$ を最大速度という。 $k_{\mathrm{cat}}$ は代謝回転数で、酵素1分子が単位時間に処理する基質の数（単位 $\mathrm{s^{-1}}$ ）。上の模型では $k_{\mathrm{cat}} = k_2$ である。 $k_2 \ll k_{-1}$ のときに限り $K_m \approx k_{-1}/k_1 = K_d$ となり、 $K_m$ を基質の親和性とみなせる。

ミカエリス・メンテン式の導出と成り立つ条件

定理・法則

ミカエリス・メンテン式（ブリッグス・ホールデンの定常状態近似）

条件

上の1基質・1中間体の模型で、初速度を測るので生成物からの逆反応と生成物阻害を無視できる。 $[\mathrm{S}] \gg [\mathrm{E}]_t$ で基質の消費を無視でき、 $[\mathrm{ES}]$ がすぐに一定値に落ち着く（ $d[\mathrm{ES}]/dt \approx 0$ ）。

主張

v = \frac{V_{\max}[\mathrm{S}]}{K_m + [\mathrm{S}]}, \qquad K_m = \frac{k_{-1} + k_2}{k_1}, \quad V_{\max} = k_2[\mathrm{E}]_t

要点

定常状態の条件 $k_1([\mathrm{E}]_t - [\mathrm{ES}])[\mathrm{S}] = (k_{-1} + k_2)[\mathrm{ES}]$ を $[\mathrm{ES}]$ について解き、 $v = k_2[\mathrm{ES}]$ に代入する。アロステリック酵素（S字形の曲線）、複数基質の反応、酵素濃度が基質と同程度の場合には、この式はそのままでは使えない。

$[\mathrm{S}] \ll K_m$ では $v \approx (V_{\max}/K_m)[\mathrm{S}] = (k_{\mathrm{cat}}/K_m)[\mathrm{E}]_t[\mathrm{S}]$ で、基質について1次。 $[\mathrm{S}] \gg K_m$ では $v \approx V_{\max}$ で0次になる。 $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ は低基質濃度での2次速度定数で、基質どうしの選択性の比較に使う。拡散律速の上限は $10^8 \sim 10^9\ \mathrm{M^{-1}\,s^{-1}}$ 程度である。

v と [S]

1/v と 1/[S]（ラインウィーバー・バーク）

Vmax1

Km2

[S] = Km で v = Vmax/2 = 0.5。二重逆数プロットの傾き Km/Vmax = 2、縦軸切片 1/Vmax = 1、横軸切片 −1/Km = -0.5。破線は Vmax = 1、Km = 2

$V_{\max}$ と $K_m$ を動かすと、左の $v$ – $[\mathrm{S}]$ 曲線と右のラインウィーバー・バークプロットが同時に変わる。曲線は $[\mathrm{S}] = K_m$ で $V_{\max}/2$ を通り、直線は縦軸を $1/V_{\max}$ 、横軸を $-1/K_m$ で切る。

Km と Vmax の求め方

直線化したプロット

ラインウィーバー・バーク（二重逆数）: $\frac{1}{v} = \frac{K_m}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{[\mathrm{S}]} + \frac{1}{V_{\max}}$
縦軸切片 $1/V_{\max}$ 、横軸切片 $-1/K_m$ 、傾き $K_m/V_{\max}$ 。低濃度の点の誤差が拡大されるので、実際の推定には非線形最小二乗が向く。
イーディー・ホフステー: $v = V_{\max} - K_m\,\frac{v}{[\mathrm{S}]}$
$v$ を $v/[\mathrm{S}]$ に対してプロットすると、傾き $-K_m$ 、縦軸切片 $V_{\max}$ 。
特定の割合に達する基質濃度: $v = f\,V_{\max} \iff [\mathrm{S}] = \frac{f}{1 - f}K_m$
$f = 1/2$ で $K_m$ 、 $f = 0.9$ で $9K_m$ 。

計算例

2点の測定から Km と Vmax を出す

$[\mathrm{S}] = 1\ \mathrm{mM}$ で $v = 20\ \mu\mathrm{M/min}$ 、 $[\mathrm{S}] = 4\ \mathrm{mM}$ で $v = 40\ \mu\mathrm{M/min}$ だった。ミカエリス・メンテン式に従うとして $K_m$ と $V_{\max}$ を求めよ。

解答

二重逆数の式に代入する（ $[\mathrm{S}]$ は mM、 $v$ は $\mu$ M/min）。

\frac{1}{20} = \frac{K_m}{V_{\max}}\cdot 1 + \frac{1}{V_{\max}}, \qquad \frac{1}{40} = \frac{K_m}{V_{\max}}\cdot\frac{1}{4} + \frac{1}{V_{\max}}

差をとると $\dfrac{3}{4}\cdot\dfrac{K_m}{V_{\max}} = \dfrac{1}{40}$ から $K_m/V_{\max} = 1/30$ 。第1式から $1/V_{\max} = 1/20 - 1/30 = 1/60$ 。よって $V_{\max} = 60\ \mu\mathrm{M/min}$ 、 $K_m = 2\ \mathrm{mM}$ 。

検算

元の式に戻すと $60 \cdot 1/(2 + 1) = 20$ 、 $60 \cdot 4/(2 + 4) = 40$ で両方の測定値を再現する。

計算例

kcat と kcat/Km

酵素の総濃度 $10\ \mathrm{nM}$ で $V_{\max} = 5\ \mu\mathrm{M/s}$ 、 $K_m = 25\ \mu\mathrm{M}$ だった。 $k_{\mathrm{cat}}$ と $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ を求めよ。

解答

k_{\mathrm{cat}} = \frac{V_{\max}}{[\mathrm{E}]_t} = \frac{5 \times 10^{-6}\ \mathrm{M/s}}{10 \times 10^{-9}\ \mathrm{M}} = 500\ \mathrm{s^{-1}}, \qquad \frac{k_{\mathrm{cat}}}{K_m} = \frac{500\ \mathrm{s^{-1}}}{25 \times 10^{-6}\ \mathrm{M}} = 2 \times 10^{7}\ \mathrm{M^{-1}\,s^{-1}}

検算

次元は $k_{\mathrm{cat}}$ が $(\mathrm{M/s})/\mathrm{M} = \mathrm{s^{-1}}$ 、 $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ が2次速度定数の $\mathrm{M^{-1}\,s^{-1}}$ 。値は拡散律速の上限 $10^8 \sim 10^9$ より小さく、矛盾しない。

阻害様式の見分け方

可逆阻害の速度式（ $\alpha = 1 + [\mathrm{I}]/K_i$ 、 $\alpha' = 1 + [\mathrm{I}]/K_i'$ ）

拮抗阻害（E にだけ結合）: $v = \frac{V_{\max}[\mathrm{S}]}{\alpha K_m + [\mathrm{S}]}$
見かけの $K_m$ が $\alpha K_m$ に増え、 $V_{\max}$ は変わらない。二重逆数プロットの直線は縦軸上で交わる。
不拮抗阻害（ES にだけ結合）: $v = \frac{V_{\max}[\mathrm{S}]}{K_m + \alpha'[\mathrm{S}]} = \frac{(V_{\max}/\alpha')[\mathrm{S}]}{K_m/\alpha' + [\mathrm{S}]}$
$V_{\max}$ と $K_m$ がどちらも $1/\alpha'$ 倍になる。二重逆数プロットの直線は平行。
混合阻害（E と ES の両方に結合）: $v = \frac{V_{\max}[\mathrm{S}]}{\alpha K_m + \alpha'[\mathrm{S}]}$
$K_i = K_i'$ の場合を非拮抗阻害（純粋な非競合阻害）と呼び、 $K_m$ は変わらず $V_{\max}$ だけが $1/\alpha$ 倍になる。直線は横軸上で交わる。

定理・法則

拮抗阻害は基質を増やすと打ち消せる

条件

可逆的な拮抗阻害で、阻害剤濃度 $[\mathrm{I}]$ が一定。

主張

$[\mathrm{S}] \to \infty$ で $v \to V_{\max}$ となり、阻害のない場合と同じ最大速度に達する。不拮抗阻害と混合阻害では最大速度は $V_{\max}/\alpha'$ にとどまる。

要点

不可逆阻害剤は活性のある酵素の量 $[\mathrm{E}]_t$ そのものを減らすので、見かけ上は $V_{\max}$ の低下として現れ、この分類には入らない。

計算例

拮抗阻害剤を加えたときの速度

$K_m = 2\ \mathrm{mM}$ 、 $V_{\max} = 50\ \mu\mathrm{M/min}$ の酵素に、 $K_i = 10\ \mu\mathrm{M}$ の拮抗阻害剤を $20\ \mu\mathrm{M}$ 加えた。 $[\mathrm{S}] = 2\ \mathrm{mM}$ での速度を、阻害剤がない場合と比べよ。また、阻害剤がないときに $v = 0.9V_{\max}$ となる基質濃度を求めよ。

解答

$\alpha = 1 + 20/10 = 3$ なので見かけの $K_m$ は $6\ \mathrm{mM}$ 。

v = \frac{50 \times 2}{6 + 2} = 12.5\ \mu\mathrm{M/min}, \qquad v_0 = \frac{50 \times 2}{2 + 2} = 25\ \mu\mathrm{M/min}

で、速度は半分になる。阻害剤がないとき $0.9V_{\max}$ に達するのは $[\mathrm{S}] = (0.9/0.1)K_m = 9K_m = 18\ \mathrm{mM}$ 。

検算

$[\mathrm{S}] = 18\ \mathrm{mM}$ を代入すると $50 \times 18/20 = 45 = 0.9 \times 50$ 。 $[\mathrm{I}] = 0$ では $\alpha = 1$ で阻害のない式に戻る。

答案でよくある誤り

1
$K_m$ をいつも基質の解離定数とみなす。 $K_m = (k_{-1} + k_2)/k_1$ が $K_d = k_{-1}/k_1$ に近いのは $k_2 \ll k_{-1}$ のときだけである。
2
$V_{\max}$ を酵素に固有の定数として比べる。 $V_{\max} = k_{\mathrm{cat}}[\mathrm{E}]_t$ は酵素量に比例する。酵素どうしの比較には $k_{\mathrm{cat}}$ や $k_{\mathrm{cat}}/K_m$ を使う。
3
二重逆数プロットの横軸切片を $1/K_m$ と読む。横軸切片は $-1/K_m$ で、負の側にある。縦軸切片が $1/V_{\max}$ 、傾きが $K_m/V_{\max}$ である。
4
非拮抗阻害と不拮抗阻害を取り違える。非拮抗阻害（ $K_i = K_i'$ ）は $K_m$ が変わらず $V_{\max}$ が下がる。不拮抗阻害は $K_m$ と $V_{\max}$ が同じ割合で下がり、プロットが平行線になる。
5
S字形の速度曲線にミカエリス・メンテン式を当てはめる。協同性のあるアロステリック酵素では、ヒル式などで別に扱う。
6
反応が進んだあとの速度で $K_m$ を求める。式が成り立つのは基質の消費と逆反応を無視できる初速度である。

生化学の前後の単元

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