タンパク質の構造アミノ酸の酸塩基・一次〜四次構造・酸素結合の協同性

タンパク質は20種類の L-アミノ酸がペプチド結合でつながった鎖で、アミノ酸の並び（一次構造）が、水素結合による二次構造、側鎖どうしの相互作用による三次構造、サブユニットの集合である四次構造を決める。側鎖や末端の電離の程度はヘンダーソン・ハッセルバルヒ式 $\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a + \log([\mathrm{A^-}]/[\mathrm{HA}])$ で求め、正味の電荷が0になる pH を等電点という。ヘモグロビンのように複数の結合部位が影響し合うタンパク質では、結合曲線がS字形になり、ヒル式で表す。

生化学の第1単元（全3単元）。

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アミノ酸とペプチド結合

定義

α-アミノ酸

同じ炭素（α炭素）にアミノ基 $-\mathrm{NH_2}$ 、カルボキシ基 $-\mathrm{COOH}$ 、水素、側鎖 $\mathrm{R}$ が結合した化合物。タンパク質を作る20種類のうち、グリシン（ $\mathrm{R} = \mathrm{H}$ ）以外はα炭素が不斉炭素で、生体のタンパク質に使われるのは L 体である。中性付近の水溶液では、アミノ基が $-\mathrm{NH_3^+}$ 、カルボキシ基が $-\mathrm{COO^-}$ になった双性イオンとして存在する。

定義

ペプチド結合

一方のアミノ酸のカルボキシ基と、もう一方のアミノ基が脱水縮合してできるアミド結合 $-\mathrm{CO{-}NH}-$ 。C–N 結合は共鳴により部分的な二重結合性をもつので回転できず、ペプチド結合を含む6原子はほぼ同一平面にある（通常はトランス配置）。主鎖の自由な回転は、α炭素の両側の二面角 $\phi$ （N–Cα）と $\psi$ （Cα–C）に限られる。

鎖には向きがあり、遊離のアミノ基が残る端を N 末端、カルボキシ基が残る端を C 末端と呼ぶ。配列は N 末端から C 末端へ書く。 $n$ 残基の鎖の配列は $20^n$ 通りある。分子量は1残基あたり平均約 $110\ \mathrm{Da}$ として概算でき、300残基なら約 $33\ \mathrm{kDa}$ になる。

一次構造から四次構造までと、それを支える結合

定義

構造の階層

一次構造：アミノ酸の配列と、ジスルフィド結合の位置。
二次構造：主鎖の $\mathrm{C{=}O}$ と $\mathrm{N{-}H}$ の水素結合が作る局所的な規則構造。αヘリックス（1回転3.6残基、残基 $i$ の $\mathrm{C{=}O}$ と残基 $i+4$ の $\mathrm{N{-}H}$ が水素結合）とβシート（平行・逆平行）が代表。
三次構造：1本の鎖全体の立体配置。疎水性側鎖が内側に集まる疎水効果、水素結合、イオン結合（塩橋）、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合で保たれる。
四次構造：複数のポリペプチド鎖（サブユニット）の集合。ヘモグロビンは $\alpha_2\beta_2$ の四量体である。

定理・法則

アンフィンセンの原理（熱力学仮説）

条件

小さな単一ドメインの球状タンパク質を、変性剤や還元剤を除いて生理的な溶液条件に戻した場合。

主張

天然の立体構造は一次構造と溶液条件で決まり、その条件で自由エネルギーが最小（またはそれに近い）状態である。リボヌクレアーゼAは尿素と還元剤で変性させても、それらを取り除くと活性のある構造に戻る。

要点

成り立たない場合も多い。大きなタンパク質や多ドメインタンパク質は凝集しやすく、細胞内ではシャペロンが折りたたみを助ける。プリオンのように、同じ配列で別の安定な構造をとる例もある。翻訳後修飾やプロペプチドの切断で構造が決まるタンパク質もある。

電離の程度と等電点の求め方

定理・法則

ヘンダーソン・ハッセルバルヒ式

条件

弱酸 $\mathrm{HA} \rightleftharpoons \mathrm{H^+} + \mathrm{A^-}$ の平衡が成り立ち、活量を濃度で近似できる希薄溶液。 $\mathrm{p}K_a$ は温度とイオン強度で変わる。

主張

\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a + \log_{10}\frac{[\mathrm{A^-}]}{[\mathrm{HA}]}

したがって酸型の割合は $\dfrac{[\mathrm{HA}]}{[\mathrm{HA}] + [\mathrm{A^-}]} = \dfrac{1}{1 + 10^{\mathrm{pH} - \mathrm{p}K_a}}$ で、 $\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a$ のとき半分が電離している。

要点

$K_a = [\mathrm{H^+}][\mathrm{A^-}]/[\mathrm{HA}]$ の両辺の常用対数をとって整理すると得られる。タンパク質の中の側鎖の $\mathrm{p}K_a$ は周囲の環境で遊離アミノ酸の値からずれるので、表の値は目安である。

定義

等電点 $\mathrm{pI}$

分子全体の正味の電荷の平均が0になる pH。電離基が2つ（α-カルボキシ基とα-アミノ基）だけのアミノ酸では、双性イオンをはさむ2つの $\mathrm{p}K_a$ の平均

\mathrm{pI} = \frac{\mathrm{p}K_{a1} + \mathrm{p}K_{a2}}{2}

になる。電離する側鎖をもつアミノ酸では、電荷0の形の両側にある2つの $\mathrm{p}K_a$ を選んで平均する。

計算例

グリシンの等電点

グリシンの $\mathrm{p}K_{a1}$ （α-カルボキシ基）を $2.34$ 、 $\mathrm{p}K_{a2}$ （α-アミノ基）を $9.60$ とする。等電点を求めよ。

解答

グリシンの電荷は、強酸性で $+1$ （ $\mathrm{H_3N^+{-}CH_2{-}COOH}$ ）、中間で $0$ （双性イオン）、強塩基性で $-1$ と変わる。電荷0の形の両側の $\mathrm{p}K_a$ は $2.34$ と $9.60$ なので

\mathrm{pI} = \frac{2.34 + 9.60}{2} = 5.97

検算

$\mathrm{pH} = 5.97$ では、 $+1$ の形の割合 $\approx 10^{2.34 - 5.97}$ と $-1$ の形の割合 $\approx 10^{5.97 - 9.60}$ がどちらも $10^{-3.63}$ で等しく、正負が打ち消し合う。

計算例

ヒスチジン側鎖のプロトン化の割合

ヒスチジンのイミダゾール基の $\mathrm{p}K_a$ を $6.0$ とする。 $\mathrm{pH}\ 7.4$ でプロトン化している（正に帯電している）割合を求めよ。

解答

酸型（プロトン化型）の割合は

\frac{1}{1 + 10^{7.4 - 6.0}} = \frac{1}{1 + 10^{1.4}} = \frac{1}{1 + 25.1} \approx 0.038

で、約 $3.8\%$ である。

検算

$\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a = 6.0$ を代入すると $1/(1+1) = 0.5$ になる。pH が $\mathrm{p}K_a$ より1上がるごとに酸型と塩基型の比が10分の1になるので、1.4上がった $7.4$ では比が $1 : 25$ で、割合 $1/26$ と合う。

ヘモグロビンの協同的な酸素結合とヒル式

リガンド結合の式

結合部位1つ（ミオグロビン型）: $\theta = \frac{[\mathrm{L}]}{K_d + [\mathrm{L}]}$
$\theta$ は結合部位が占有されている割合、 $K_d$ は解離定数。 $[\mathrm{L}] = K_d$ で半飽和。
ヒル式: $\theta = \frac{[\mathrm{L}]^{n}}{K^{n} + [\mathrm{L}]^{n}}, \qquad \log\frac{\theta}{1 - \theta} = n\log[\mathrm{L}] - n\log K$
$n$ はヒル係数、 $K$ は半飽和の濃度。酸素では濃度の代わりに分圧 $p\mathrm{O_2}$ を使い、 $K$ を $P_{50}$ と書く。

ヒル係数 $n$ は結合部位の数そのものではない。 $n > 1$ は正の協同性（1つ結合すると次が結合しやすい）、 $n = 1$ は協同性なし、 $n < 1$ は負の協同性を表す。ヘモグロビンの結合部位は4つだが、実測の $n$ は約3で、4より小さい。ヒル式は半飽和付近の近似で、 $\theta$ が0や1に近い範囲ではヒルプロットの傾きは1に近づく。

計算例

肺と組織のあいだで放出される酸素の割合

ヘモグロビンの酸素結合を $P_{50} = 26\ \mathrm{mmHg}$ 、 $n = 2.8$ のヒル式で近似する。肺（ $100\ \mathrm{mmHg}$ ）と、活動中の組織（ $20\ \mathrm{mmHg}$ ）での飽和度を求め、その差を、同じ $P_{50}$ で $n = 1$ の場合と比べよ。

解答

\theta(100) = \frac{100^{2.8}}{26^{2.8} + 100^{2.8}} \approx 0.978, \qquad \theta(20) = \frac{20^{2.8}}{26^{2.8} + 20^{2.8}} \approx 0.324

なので、肺で結合した酸素のうち飽和度にして $0.978 - 0.324 \approx 0.65$ を組織で放出する。 $n = 1$ なら $\theta(100) = 100/126 \approx 0.794$ 、 $\theta(20) = 20/46 \approx 0.435$ で、差は約 $0.36$ にとどまる。協同性があると、狭い分圧の範囲で飽和度が大きく変わる。

検算

$p\mathrm{O_2} = P_{50} = 26$ を代入すると $n$ によらず $\theta = 1/2$ 。また $\theta(20)$ からヒルプロットの値を計算すると $\log_{10}(0.324/0.676) \approx -0.319 = 2.8 \log_{10}(20/26)$ で、傾き $n$ と一致する。

答案でよくある誤り

1
側鎖が電離するアミノ酸の等電点を、3つの $\mathrm{p}K_a$ の平均で出す。電荷が $+1 \to 0 \to -1$ と変わる順に形を並べ、電荷0の形の両側にある2つの $\mathrm{p}K_a$ だけを平均する。
2
ヒル係数を結合部位の数と同じものとして扱う。 $n$ は協同性の強さの指標で、結合部位の数を上限とする。ヘモグロビンは部位4つで $n \approx 3$ である。
3
二次構造の水素結合を側鎖どうしの結合と書く。αヘリックスとβシートの水素結合は主鎖の $\mathrm{C{=}O}$ と $\mathrm{N{-}H}$ の間にできる。側鎖の相互作用は主に三次構造を決める。
4
ペプチド結合のまわりで自由に回転できるとする。C–N 結合は部分的な二重結合性で回転できず、主鎖の自由度は $\phi$ と $\psi$ である。
5
$\mathrm{pH} > \mathrm{p}K_a$ のとき酸型が多いとする。 $\mathrm{pH}$ が $\mathrm{p}K_a$ より大きいと塩基型（ $\mathrm{A^-}$ ）が多い。 $\mathrm{pH} = \mathrm{p}K_a$ で半々という基準から確かめる。

生化学の前後の単元

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