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DNAの複製と修復二重らせんの構造・半保存的複製・PCRの計算・修復の仕組み

DNA は2本の逆平行なポリヌクレオチド鎖が A–T、G–C の相補的な塩基対で結ばれた二重らせんで、複製では2本の鎖がそれぞれ鋳型になり、新しい2本鎖はどちらも古い鎖と新しい鎖を1本ずつもつ（半保存的複製）。DNA ポリメラーゼはプライマーの 3′3' 末端にだけヌクレオチドを付け足すので、合成は 5′→3′5' \to 3' の向きに限られ、片方の鎖は短い断片（岡崎断片）として不連続に作られる。複製の誤りや損傷は、ミスマッチ修復、塩基除去修復、ヌクレオチド除去修復、二本鎖切断の修復などで、損傷の種類ごとに直される。

分子生物学 の第1単元（全3単元）。

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DNAの二重らせん構造と塩基組成

定義

ヌクレオチドと鎖の向き

ヌクレオチドは塩基、五炭糖（DNA ではデオキシリボース）、リン酸からなる。糖の 5′5' 位のリン酸と隣の糖の 3′3' 位のヒドロキシ基がホスホジエステル結合でつながり、鎖の一端に 5′5' リン酸、他端に 3′3' ヒドロキシ基が残る。配列は 5′5' 末端から 3′3' 末端へ書く。

定義

B 型二重らせん

細胞内の DNA の主な形。2本の鎖は逆平行で、塩基対は A–T が水素結合2本、G–C が3本で結ばれる。右巻きで、1回転あたり約10.5塩基対、塩基対の間隔は約 0.34 nm0.34\ \mathrm{nm}、直径は約 2 nm2\ \mathrm{nm} である。らせんの表面に主溝と副溝があり、タンパク質は主に主溝で塩基配列を読む。

定理・法則

シャルガフの規則

条件

二本鎖 DNA の全体の塩基組成について。一本鎖 DNA ゲノムや RNA、二本鎖 DNA の片方の鎖だけには当てはまらない。

主張

[A]=[T],[G]=[C],[A]+[G]=[T]+[C][\mathrm{A}] = [\mathrm{T}], \qquad [\mathrm{G}] = [\mathrm{C}], \qquad [\mathrm{A}] + [\mathrm{G}] = [\mathrm{T}] + [\mathrm{C}]

GC 含量 ([G]+[C])/全塩基([\mathrm{G}] + [\mathrm{C}])/\text{全塩基} は生物種によって異なる。

要点

相補的な塩基対から直接出る。A と T、G と C が必ず対をなすので、二本鎖全体ではそれぞれの数が等しい。

計算例

塩基組成と DNA の長さ

ある二本鎖 DNA で A が全塩基の30%を占める。(1) G の割合を求めよ。(2) 長さ 4.6×1064.6 \times 10^{6} 塩基対の環状 DNA を伸ばしたときの長さを、B 型として求めよ。

解答

(1) T も30%なので、G と C で残りの40%を分け、G は20%。

(2) 4.6×106×0.34 nm≈1.56×106 nm=1.56 mm4.6 \times 10^{6} \times 0.34\ \mathrm{nm} \approx 1.56 \times 10^{6}\ \mathrm{nm} = 1.56\ \mathrm{mm}。

検算

(1) A+T+G+C=30+30+20+20=100\mathrm{A} + \mathrm{T} + \mathrm{G} + \mathrm{C} = 30 + 30 + 20 + 20 = 100。(2) 細胞の大きさ（数 μ\mum）の数百倍で、DNA が折りたたまれて収まっていることと合う。

半保存的複製の仕組み

定理・法則

DNA ポリメラーゼの合成の規則

条件

細胞の複製型 DNA ポリメラーゼ（大腸菌の DNA ポリメラーゼ III、真核生物のポリメラーゼ δ・ε など）。

主張

鋳型鎖と、3′3' ヒドロキシ基をもつプライマーが必要で、デオキシヌクレオシド三リン酸をプライマーの 3′3' 末端に付加する。新しい鎖は 5′→3′5' \to 3' の向きにだけ伸び、鋳型は 3′→5′3' \to 5' の向きに読まれる。多くは 3′→5′3' \to 5' エキソヌクレアーゼ活性をもち、誤って入れた塩基を取り除く（校正）。

要点

プライマーは RNA で、プライマーゼが合成する。RNA ポリメラーゼはプライマーなしで合成を始められる点が DNA ポリメラーゼと違う。

複製は複製起点から両方向に進み、2つの複製フォークができる。フォークでは次の酵素が働く。

  • ヘリカーゼが塩基対をほどき、一本鎖結合タンパク質がほどけた鎖を安定させる。
  • トポイソメラーゼがフォークの前方にたまるねじれを解消する。
  • リーディング鎖はフォークの進む向きに連続して合成される。ラギング鎖はフォークと逆向きにしか伸ばせないので、プライマーごとに短い岡崎断片（細菌で1000〜2000塩基、真核生物で100〜200塩基程度）として合成される。
  • RNA プライマーは除かれて DNA に置き換えられ（大腸菌では DNA ポリメラーゼ I）、DNA リガーゼが断片をつなぐ。

直鎖状の染色体では、ラギング鎖の末端の最後のプライマーを除いた部分を埋められず、複製のたびに末端が短くなる。テロメラーゼは自身がもつ RNA を鋳型にテロメア配列を付け足してこれを補う。

計算例

メセルソン・スタールの実験の予想

15N^{15}\mathrm{N} だけを含む培地で育てた大腸菌を 14N^{14}\mathrm{N} の培地に移し、nn 世代後の DNA を密度勾配遠心にかける。半保存的複製なら、重い・中間・軽い DNA の割合はどうなるか。

解答

最初の2本の重い鎖は壊れずに残り、毎世代1本ずつ別々の二本鎖に入る。n≥1n \ge 1 世代後の二本鎖は 2n2^n 本で、そのうち重い鎖を含む中間密度のものは2本。

中間=22n,軽い=1−22n,重い=0\text{中間} = \frac{2}{2^n}, \qquad \text{軽い} = 1 - \frac{2}{2^n}, \qquad \text{重い} = 0

1世代後はすべて中間、2世代後は中間と軽いが半分ずつ、3世代後は中間が 1/41/4 になる。

検算

保存的複製なら1世代後に重いと軽いが半々で中間は現れず、分散的複製なら2世代後も単一のバンドになる。1世代後に中間だけ、2世代後に中間と軽いの2本という観察は、半保存的複製だけに合う。

計算例

複製にかかる時間の概算

4.6×1064.6 \times 10^{6} 塩基対の環状染色体が、1つの起点から両方向に複製される。各フォークの速さを毎秒1000塩基と仮定すると、複製に何分かかるか。

解答

2つのフォークがそれぞれ半分を受け持つので

4.6×106/21000 s−1=2300 s≈38 分\frac{4.6 \times 10^{6} / 2}{1000\ \mathrm{s^{-1}}} = 2300\ \mathrm{s} \approx 38\ \text{分}

検算

フォークの速さは温度や増殖条件で変わるので、結果も仮定に比例して変わる。細菌が速い増殖条件でこれより短い間隔で分裂できるのは、前の複製が終わる前に次の複製を起点から始めるためである。

PCRの分子数と融解温度

PCR の理想的な増幅
Nn=N0 2n,増幅効率 E のとき Nn=N0(1+E)nN_n = N_0\,2^{n}, \qquad \text{増幅効率 } E \text{ のとき } N_n = N_0(1 + E)^{n}

nn はサイクル数。E=1E = 1 が毎サイクル完全に倍加する場合。後半のサイクルでは基質やプライマーが減って EE が下がる。

目的の長さの二本鎖の数
2n−2n(長い鋳型 1 分子から、n サイクル後)2^{n} - 2n \quad (\text{長い鋳型 } 1 \text{ 分子から、} n \text{ サイクル後})

元の2本の鎖と、それを鋳型にした片側だけ長い鎖が残るため、全体の 2n2^n より少ない。3サイクル目に初めて2分子現れる。

短いオリゴヌクレオチドの融解温度の目安（ウォレス則）
Tm≈2 (#A+#T)+4 (#G+#C)  [∘C]T_m \approx 2\,(\#\mathrm{A} + \#\mathrm{T}) + 4\,(\#\mathrm{G} + \#\mathrm{C})\ \ [{}^{\circ}\mathrm{C}]

20塩基程度までのプライマーの目安で、塩濃度やオリゴの濃度で変わる。G–C 対は水素結合が多く、塩基の積み重なりの安定化も大きいので、GC 含量が高いほど TmT_m が上がる。

計算例

PCR の増幅とプライマーの融解温度

(1) 鋳型1分子から30サイクルで、理想的には何分子になるか。(2) プライマー 5′5'-AGCTTGCAAGCTTACGATCG-3′3' の TmT_m をウォレス則で見積もれ。

解答

(1) 230=1 073 741 824≈1.07×1092^{30} = 1\,073\,741\,824 \approx 1.07 \times 10^{9} 分子。目的の長さの二本鎖はそのうち 230−602^{30} - 60 で、ほぼ全部である。

(2) 20塩基のうち A が5、T が5、G が5、C が5。Tm≈2×10+4×10=60 ∘CT_m \approx 2 \times 10 + 4 \times 10 = 60\ {}^{\circ}\mathrm{C}。

検算

(1) 210=1024≈1032^{10} = 1024 \approx 10^3 なので 230≈1092^{30} \approx 10^{9}。(2) 塩基の数の合計 10+10=2010 + 10 = 20 がプライマーの長さと一致する。

損傷の種類と修復機構

定義

主な修復経路

  • ミスマッチ修復：複製で生じた誤対合を直す。大腸菌では MutS が誤対合を認識し、新しい鎖がまだメチル化されていない GATC 配列を手がかりに、新しい鎖の側を切り出して合成し直す。
  • 塩基除去修復：脱アミノ化（シトシン→ウラシル）や酸化などで傷んだ1塩基を、DNA グリコシラーゼが除いて AP 部位を作り、そこを切って埋め直す。
  • ヌクレオチド除去修復：紫外線によるピリミジン二量体など、らせんをゆがめる大きな損傷を、前後を含むオリゴヌクレオチドごと切り出す。ヒトでこの経路が欠けると色素性乾皮症になる。
  • 光回復：光回復酵素（フォトリアーゼ）が可視光のエネルギーでピリミジン二量体を直接開裂する。有胎盤哺乳類はこの酵素をもたない。
  • 二本鎖切断の修復：非相同末端結合（NHEJ）は切れた末端を直接つなぎ、塩基の欠失や挿入が起こりやすい。相同組換え修復は姉妹染色分体を鋳型に使うので正確だが、主に S 期と G2\mathrm{G_2} 期に働く。

定理・法則

相補鎖があるから修復できる

条件

損傷が二本鎖の片方の鎖だけにある場合（ミスマッチ、塩基除去、ヌクレオチド除去修復）。

主張

残ったもう一方の鎖を鋳型にして、失われた情報を元どおりに合成し直せる。両方の鎖が同じ場所で切れた二本鎖切断では鋳型がないので、姉妹染色分体や相同染色体を使う相同組換えでしか正確に直せない。

答案でよくある誤り

  1. 1

    シャルガフの規則を一本鎖や片方の鎖にも当てはめる。[A]=[T][\mathrm{A}] = [\mathrm{T}] が成り立つのは二本鎖全体で、片方の鎖の A の数は、もう一方の鎖の T の数に等しい。

  2. 2

    ラギング鎖は 3′→5′3' \to 5' の向きに合成されると書く。どちらの鎖も 5′→3′5' \to 3' に合成され、ラギング鎖は短い断片を逆向きに繰り返し作ってつなぐ。

  3. 3

    相補鎖を書くときに向きをそろえない。5′5'-ATGC-3′3' の相補鎖は 3′3'-TACG-5′5' で、5′5' から書き直すと 5′5'-GCAT-3′3' になる。

  4. 4

    PCR の産物がすべて目的の長さだとする。nn サイクル後の 2n2^n 分子のうち、両端がプライマーで決まる分子は 2n−2n2^n - 2n で、最初の数サイクルではまだ少ない。

  5. 5

    非相同末端結合を正確な修復とする。NHEJ は鋳型を使わないので、つなぎ目で数塩基の欠失や挿入が起こりやすい。

分子生物学の前後の単元

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